MDA-MB-231-LUC人乳腺癌荧光素酶标记细胞 处理方法1. 质粒部分
1.酶切载体:pGL4.10(luc2)由酶切获得1400bp的luc2基因片断;EGFP和mCherry片段由PCR扩增获得700-800bp左右片段;pSin-hyg-T2A载体酶切线性化。
2.电泳和胶回收:上述酶切产物DNA电泳,TAKARA试剂盒胶回收,回收产物取少量电泳鉴定。
3.连接载体与目的片段:使用Invitrogen T4连接酶连接luc2、EGFP或mCherry片段和pSin-hyg-T2A线性化载体,连接使用20ul体系,25℃,10min。
4.转化:感受态菌One Shot Stbl3在冰上融化后,加入连接产物,静置25min后在水浴42℃,45sec热休克,后加入250ul无抗培养基225转摇菌1h,将转化的菌铺于有氨苄抗性平板37度过夜。
5.挑取单克隆:观察平板后挑取15个单克隆至含2ml氨苄抗性 LB培养基摇菌管中,255转摇菌6.5h。
6.小抽质粒与鉴定:使用碱裂解法小抽,质粒用25ul含RNA酶ddH2O溶解;酶切鉴定: 重组质粒用通过酶切鉴定。
7.荧光素表达鉴定: 重组质粒pSin-hyg-GFP/luc2(以下简称Gluc)或pSin-hyg-mCherry/luc2(以下简称Mluc) 转染293T细胞:DNA定量后,使用PEI转染Gluc或Mluc至24孔板已预铺的293T细胞中。转染采用脂质体法转染,试剂采用JetPEI (Polyplus公司)。两管EP管中分别加入50ul生理盐水,其中一管加入1ug量的质粒(DNA体积=1ug/DNA浓度),轻轻震荡混匀,再轻微离心;在另一管中加入PEI 2ul轻轻震荡混匀,轻微离心,然后把PEI管中的溶液加入含有的质粒管中,室温孵育20min。将脂质体包绕DNA的混合液加入需要转染的24孔内,37 ℃、5 % CO2条件下培养,8小时后换培养液。
8.报告基因检测:Passive Lysis Agent裂解细胞,加入荧光素酶作用底物,将转染质粒的细胞与阴性,阳性对照共同进行单报告基因检测。
9.质粒中抽:取1ml转染报告基因检测正确的菌液加入100ml氨苄抗性的LB培养基中摇菌过夜,使用Invitrogen试剂盒中抽,产物电泳鉴定,-20℃保存。
原创作者:上海谷研实业有限公司