详细内容
本试剂盒适用于PCR产物的克隆,可将PCR产物连接到pTG-T载体上,便于进行下一步实验。DNA片段连接是经常出问题的步骤,为了提高连接效率,本试剂盒提供了两种连接Buffer供不同情况选择:10×Ligation Buffer Ⅰ适合置于16℃连接过夜,可获得佳连接效果;2×Ligation Buffer Ⅱ为快速连接Buffer,25℃连接10分钟即可转化,快捷方便。
产品名称 | 英文名称 | 规格 |
pTG-T载体连接试剂盒 | pTG-T Vector Ligation Kit | 20次|60次 |
pTG-T是一种高效克隆PCR产物的用载体,它是由一种克隆载体在EcoRV酶切位点处切开,在两侧的3′端添加T而成。由于大部分耐热聚合酶反应时都会在PCR产物的3′端添加一个A,可与pTG-T 3′端的T互补连接,因此可大大提高PCR产物的连接和克隆效率。连接使用的PCR片段3′端应带有A末端,如果是使用pfu等高保真聚合酶扩增的不带A末端的片段,应使用平末端连接试剂盒先加A末端后再连接。
带有插入片段的重组子可根据α互补原理,进行蓝白斑筛选,判断载体中有无外源基因的插入(白色克隆为阳性重组克隆,蓝色的为载体自连的克隆,具体筛选原理参考分子克隆等书籍)。克隆后,可使用通用引物T7、SP6进行测序。
保存条件:-20℃保存,避免反复冻融(载体和连接试剂可以适当的分装成小份,防止反复冻融,以保证质量)。
产品仅用于科研操作程序:
注意:重要的是及时固定,并在固定液中加入0.1%的DEPC处理,以抑制RNA酶对mRNA的分解作用。此外,过度固定对原位杂交有明显的不利影响。
1.玻片的处理:一般采用多聚赖氨酸或APES。切片厚度10-20μm。
2.细胞在多聚赖氨酸处理的盖玻片上进行培养,条件为37℃和5%的CO2,所用培养基为Dulbecco基础培养基。细胞长好后0.1M PBS(PH7.4)洗2分钟×3次。
3.培养细胞和冰冻切片均可用下述方法固定:固定液为4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6),含有1/1000 DEPC。室温固定 20--30分钟。蒸馏水充分洗涤,干燥后-20℃冰冻可保存2周以上。
4.30%H2O2 1份+纯甲醇50份混合,室温处理30分钟。蒸馏水洗涤3次。
5.暴露mRNA核酸片段:切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶(1ml 3% 柠檬酸加2滴浓缩型胃蛋白酶,混匀),37℃或室温消化5—120钟。有时也可以不消化。原位杂交用 PBS洗3次×5分钟。蒸馏水洗1次。
6.后固定:胃蛋白酶消化后才需要。固定液为1%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6),含有1/1000 DEPC。室温固定 10分钟。蒸馏水洗涤3次。
7.预杂交:湿盒的准备——干的杂交盒底部加20%甘油20ml以保持湿度。按每张切片20μι加预杂交液。恒温箱38-42℃2—4小时。吸取多余液体,不洗。
8.杂交——按每张切片20μι杂交液,加在切片上。将原位杂交用盖玻片的保护膜揭开后,盖在切片上。恒温箱38-42℃杂交过夜(根据杂交情况可以调节)。
9.杂交后洗涤:揭掉盖玻片,37℃左右水温的2×SSC洗涤5分钟×2次;37℃0.5×SSC洗涤15分钟×1次; 37℃0.2×SSC洗涤15分钟×1次(如果有非特异性染色,重复0.2×SSC洗涤15分钟×1-2次)。
10.滴加封闭液:37℃30分钟。甩去多余液体,不洗
11.滴加生物素化鼠抗*:37℃ 60分钟或室温120分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×4次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。
12.滴加SABC:37℃20分钟或室温30分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×3次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。
13.滴加生物素化过氧化物酶:37℃20分钟或室温30分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×4次。
14.DAB显色:使用DAB显色试剂盒—1ml蒸馏水加显色剂A,B,C各一滴,混匀,加至标本上。一般显色20-30分钟。若无背景出现则可继续显色。也可自配DAB显色剂后显色。充分水洗。
15.必要时苏木素复染,充分水洗。
16.酒精脱水,二甲苯透明,封片。
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更新时间:2023/12/19 10:15:24
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