Rosetta-gami 2(DE3)化学感受态细胞

详细内容

Rosetta-gami 2(DE3)菌株集合了Rosetta 2和Origami 2两种菌株的优点：

pRARE2赋予其Rosetta2菌株的优点——补充缺乏的7种稀有密码子(AUA，AGG，AGA，CUA，CCC，GGA和CGG)对应的tRNA，提高外源基因的表达水平。

gor522::Tn10 trxB赋予其Origami2菌株的优点——突变的硫氧还蛋白还原酶(thioredoxin reductase)(trxB)和谷胱甘肽还原酶(glutathione reductase)(gor)基因，它们是还原途径的两个关键酶，其突变有利于高效形成正确折叠的含有二硫键的蛋白，增强蛋白的可溶性；同时该菌株不具有卡那霉素抗性，可用于具有卡那霉素抗性质粒的蛋白表达。

该菌株染色体整合了λDE3区(DE3区含有T7RNA聚合酶)适合 T7启动子诱导的蛋白表达。

Rosetta-gamiB(DE3)菌株具有氯霉素，链霉素，四环素抗性，由特殊工艺制作，经pUC19质粒检测转化效率高达108 cfu/μg DNA。

保存条件：-80℃

基因型：

D(ara-leu)7697 DlacX74 DphoA PvuII phoR araD139 ahpC galE galK rpsL(DE3)F’[lac+lacIq pro] gor522::Tn10 trxB pRARE2(CamR，StrR，TetR)

操作说明：

1.Rosetta-gami 2(DE3)菌株感受态细胞从-80℃拿出，迅速插入冰中，5分钟后待菌块融化，加入目的DNA并用手拨打EP管底轻轻混匀(避免用枪吸打)，冰中静置25分钟。

2.42℃水浴热激45，迅速放回冰上并静置2分钟，晃动会降低转化效率。

3.向离心管中加入700 μl不含抗生素的无菌培养基(2YT或LB)，混匀后37℃，200 rpm复苏60分钟。

4.5000 rpm离心一分钟收菌，留取100 μl左右上清轻轻吹打重悬菌块并涂布到含所选质粒筛选抗生素的2YT或LB培养基上。5.将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养。

注意事项：

1.感受态细胞好在冰中缓慢融化，插入冰中8分钟内加入目标DNA，不可在冰中放置时间过长，长时间存放会降低转化效率。

2.混入质粒时应轻柔操作。

3.转化高浓度的质粒可相应减少终用于涂板的菌量。

4.诱导时，IPTG浓度可选(0.1-2 mM均可)。

5.为获得需要量的蛋白，佳诱导时间，温度，IPTG浓度需实验者优化。
硬脂酰胺(>90.0%(GC))Stearamide质量规格：>90.0%(GC)  犬血纤蛋白原降解产物(FDP)试剂盒 Canine Fibrinogen Degradation Product,FDP ELISA Kit  人胸腺基质细胞生成素(TSLP)ELISA 试剂盒 96T/48T 试剂盒 组装/原装

丁基邻苯二甲酰羟乙酸丁酯(>95.0%(GC))Butyl Phthalyl Butyl Glycolate质量规格：>95.0%(GC)  英文名称Mouse17-ANPELISAKit小鼠17-羟-孕同(17-ANP)规格：96T/48T  猪皮质醇(Coisol)试剂盒 Porcine Coisol ELISA Kit

间苯二酸双(2-乙基己基)酯(>98.0%(GC))Bis(2-ethylhexyl) Isophthalate质量规格：>98.0%(GC)  肠产毒性(EerotoxigenicE.coli)鉴定16SrDNAPCR扩增检测试剂盒20  Humanmacrophageinflammatoryprotein5,MIP-5ELISAKit 人巨噬细胞炎性蛋白5(MIP-5)ELISA试剂盒 96T/48T 进口分装

油酸甲酯(分析标准品,>99.0%(GC))Methyl oleate质量规格：分析标准品,>99.0%(GC)  RatFreeThyroxine,FT4ELISA试剂盒大鼠游离甲状腺素(FT4)ELISA试剂盒规格：96T/48T  Humanmaixmetalloproteinase9/GelatinaseB,MMP-9ELISA试剂盒人基质金属蛋白酶9/明胶酶B(MMP-9/GelatinaseB)ELISA试剂盒规格：96T/48T
小鼠16α羟基雌酮1(16-αOHE-1)ELISA检测试剂盒Mouse16-αHydroxyesogen1,16-αOHE-1ELISAKit 96T/48T  518-17-2吴茱萸碱厂家  Evodiamine

人巨噬细胞炎性蛋白5(MIP-5)试剂盒 Human MIP-5 ELISA Kit  84-26-4吴茱萸碱说明书  Rutecarpine

Ratadvancedglycationendproducts,AGEsELISAKit大鼠晚期糖基化终末产物(AGEs)ELISA试剂盒规格：96T/48T  7432-28-2五味子醇甲品牌  Schisandrin

载玻片细胞VEGF蛋白表达NBT显色光学显微镜检测试剂盒10/20  58546-54-6五味子醇乙规格  Schisandrol B

Mouse5-Hydroxyyptamine,5HTELISA试剂盒小鼠5羟色胺(5-HT)ELISA试剂盒规格：96T/48T  61281-38-7五味子甲素厂家  schisandrin A
Rosetta-gami 2(DE3)化学感受态细胞35825-57-1隐丹参酮说明书  Cryptotanshi  载玻片细胞IKB-ALPHA蛋白表达NBT显色光学显微镜检测试剂盒10/20

35790-95-5α－常春藤苷品牌 α-hederin   载玻片细胞IGF蛋白表达NBT显色光学显微镜检测试剂盒10/20

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35354-74-6和厚朴酚品牌  Honokiol   载玻片细胞GSK-3ALPHA蛋白表达NBT显色光学显微镜检测试剂盒10/20
产品仅用于科研操作程序：
注意：重要的是及时固定，并在固定液中加入0.1%的DEPC处理，以抑制RNA酶对mRNA的分解作用。此外，过度固定对原位杂交有明显的不利影响。
1．玻片的处理：一般采用多聚赖氨酸或APES。切片厚度10-20μm。
2．细胞在多聚赖氨酸处理的盖玻片上进行培养，条件为37℃和5%的CO2，所用培养基为Dulbecco基础培养基。细胞长好后0.1M PBS(PH7.4)洗2分钟×3次。
3．培养细胞和冰冻切片均可用下述方法固定：固定液为4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)，含有1/1000 DEPC。室温固定 20－－30分钟。蒸馏水充分洗涤，干燥后-20℃冰冻可保存2周以上。
4．30%H2O2 1份+纯甲醇50份混合，室温处理30分钟。蒸馏水洗涤3次。
5．暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶(1ml 3% 柠檬酸加2滴浓缩型胃蛋白酶，混匀)，37℃或室温消化5—120钟。有时也可以不消化。原位杂交用 PBS洗3次×5分钟。蒸馏水洗1次。
6.后固定：胃蛋白酶消化后才需要。固定液为1%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)，含有1/1000 DEPC。室温固定 10分钟。蒸馏水洗涤3次。
7．预杂交：湿盒的准备——干的杂交盒底部加20%甘油20ml以保持湿度。按每张切片20μι加预杂交液。恒温箱38-42℃2—4小时。吸取多余液体，不洗。
8．杂交——按每张切片20μι杂交液，加在切片上。将原位杂交用盖玻片的保护膜揭开后，盖在切片上。恒温箱38-42℃杂交过夜(根据杂交情况可以调节)。
9．杂交后洗涤：揭掉盖玻片，37℃左右水温的2×SSC洗涤5分钟×2次；37℃0.5×SSC洗涤15分钟×1次; 37℃0.2×SSC洗涤15分钟×1次(如果有非特异性染色，重复0.2×SSC洗涤15分钟×1-2次)。
10.滴加封闭液：37℃30分钟。甩去多余液体，不洗
11.滴加生物素化鼠抗*：37℃ 60分钟或室温120分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×4次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。
12.滴加SABC：37℃20分钟或室温30分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×3次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。
13.滴加生物素化过氧化物酶：37℃20分钟或室温30分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×4次。
14.DAB显色：使用DAB显色试剂盒—1ml蒸馏水加显色剂Ａ，Ｂ，C各一滴，混匀，加至标本上。一般显色20-30分钟。若无背景出现则可继续显色。也可自配DAB显色剂后显色。充分水洗。
15.必要时苏木素复染，充分水洗。
16.酒精脱水，二甲苯透明，封片。

更新时间：2024/4/2 13:45:38

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