详细内容
本试剂盒是基于PCR原理向目的DNA片段(一般为质粒)中引入碱基的点突变,多个邻近密码子的突变,单个或多个邻近密码子的缺失(deletion)或插入(insertion)等。一般宿主菌培养扩增的质粒DNA是甲基化的,PCR扩增新合成的DNA是非甲基化的。先以待突变的甲基化质粒为模板,利用超快高保真的SuperPfu聚合酶实现突变质粒的合成(非甲基化,包含突变点,且有两个缺刻点nick点),再利用Dpn I酶选择性降解甲基化的模板质粒 ,剩下的新合成非甲基化的突变质粒转入后,质粒中有两个nick位
产品名称 | 英文名称 | 规格 |
一管式定点突变试剂盒 | One Tube Site-specific Mutagenesis Kit | 10次|20次 |
试剂盒组分(10次):
SuperPfu DNA polymerase——————5μl
10×SuperPfu Buffer————————100μl
Dpn I——————-——————-——5μl
10mM dNTP Mixture-——————-——25μl
试剂盒特点:
1、简单,一个PCR管中完成所有操作,速度快。
2、采用部分重叠引物设计,使PCR呈指数扩增,扩增产物凝胶电泳可见增加成功率。
3、效率高,使用Dpn I去除非突变模板,突变效率高达90%;不需要使用特殊感受态细胞降解非突变质粒。
4、采用分子进化改造的SuperPfu可以提供4倍-6倍于pfu的扩增速率提高和3倍于pfu的超高保真性。
储存条件:-20℃,有效期一年。
产品仅用于科研操作程序:
注意:重要的是及时固定,并在固定液中加入0.1%的DEPC处理,以抑制RNA酶对mRNA的分解作用。此外,过度固定对原位杂交有明显的不利影响。
1.玻片的处理:一般采用多聚赖氨酸或APES。切片厚度10-20μm。
2.细胞在多聚赖氨酸处理的盖玻片上进行培养,条件为37℃和5%的CO2,所用培养基为Dulbecco基础培养基。细胞长好后0.1M PBS(PH7.4)洗2分钟×3次。
3.培养细胞和冰冻切片均可用下述方法固定:固定液为4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6),含有1/1000 DEPC。室温固定 20--30分钟。蒸馏水充分洗涤,干燥后-20℃冰冻可保存2周以上。
4.30%H2O2 1份+纯甲醇50份混合,室温处理30分钟。蒸馏水洗涤3次。
5.暴露mRNA核酸片段:切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶(1ml 3% 柠檬酸加2滴浓缩型胃蛋白酶,混匀),37℃或室温消化5—120钟。有时也可以不消化。原位杂交用 PBS洗3次×5分钟。蒸馏水洗1次。
6.后固定:胃蛋白酶消化后才需要。固定液为1%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6),含有1/1000 DEPC。室温固定 10分钟。蒸馏水洗涤3次。
7.预杂交:湿盒的准备——干的杂交盒底部加20%甘油20ml以保持湿度。按每张切片20μι加预杂交液。恒温箱38-42℃2—4小时。吸取多余液体,不洗。
8.杂交——按每张切片20μι杂交液,加在切片上。将原位杂交用盖玻片的保护膜揭开后,盖在切片上。恒温箱38-42℃杂交过夜(根据杂交情况可以调节)。
9.杂交后洗涤:揭掉盖玻片,37℃左右水温的2×SSC洗涤5分钟×2次;37℃0.5×SSC洗涤15分钟×1次; 37℃0.2×SSC洗涤15分钟×1次(如果有非特异性染色,重复0.2×SSC洗涤15分钟×1-2次)。
10.滴加封闭液:37℃30分钟。甩去多余液体,不洗
11.滴加生物素化鼠抗*:37℃ 60分钟或室温120分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×4次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。
12.滴加SABC:37℃20分钟或室温30分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×3次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。
13.滴加生物素化过氧化物酶:37℃20分钟或室温30分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×4次。
14.DAB显色:使用DAB显色试剂盒—1ml蒸馏水加显色剂A,B,C各一滴,混匀,加至标本上。一般显色20-30分钟。若无背景出现则可继续显色。也可自配DAB显色剂后显色。充分水洗。
15.必要时苏木素复染,充分水洗。
16.酒精脱水,二甲苯透明,封片。
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更新时间:2024/3/22 9:53:15
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