多片段一步法快速克隆试剂盒

详细内容

本试剂盒是一款简单、快速、高效的多片段DNA定向克隆产品，该试剂盒可以将PCR产物定向克隆至任意载体的任意位点。将载体在克隆位点进行线性化，并在插入片段PCR引物5’端引入线性化克隆载体末端序列，使得插入片段PCR产物5’和3’末端分别带有和线性化克隆载体两末端对应的完全一致的序列(15 bp～20 bp)。将这种两端带有载体末端序列的PCR产物和线性化克隆载体按一定比例混合，在重组酶的催化下，仅需反应15-50 min即可进行转化，完成定向克隆。克隆阳性率可达95%以上。克隆载体酶切产物或PCR产物和

试剂盒中2×Enzyme Premix预混了重组酶和重组反应所需缓冲液，并添加了独特的重组增强因子，可显著提高重组克隆效率，即便使用低效率感受态细胞 (107cfu/μg)也可实现高效克隆 (100cfu/ng Vector)，使用该试剂盒，可以一次实现多至5个片段的顺序拼接克隆。重组体系还兼容常规酶切、PCR反应体系。

产品用途：该试剂盒可用于多片段拼接克隆、全基因合成和DNA定点突变。
产品仅用于科研操作程序：
注意：重要的是及时固定，并在固定液中加入0.1%的DEPC处理，以抑制RNA酶对mRNA的分解作用。此外，过度固定对原位杂交有明显的不利影响。
1．玻片的处理：一般采用多聚赖氨酸或APES。切片厚度10-20μm。
2．细胞在多聚赖氨酸处理的盖玻片上进行培养，条件为37℃和5%的CO2，所用培养基为Dulbecco基础培养基。细胞长好后0.1M PBS(PH7.4)洗2分钟×3次。
3．培养细胞和冰冻切片均可用下述方法固定：固定液为4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)，含有1/1000 DEPC。室温固定 20－－30分钟。蒸馏水充分洗涤，干燥后-20℃冰冻可保存2周以上。
4．30%H2O2 1份+纯甲醇50份混合，室温处理30分钟。蒸馏水洗涤3次。
5．暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶(1ml 3% 柠檬酸加2滴浓缩型胃蛋白酶，混匀)，37℃或室温消化5—120钟。有时也可以不消化。原位杂交用 PBS洗3次×5分钟。蒸馏水洗1次。
6.后固定：胃蛋白酶消化后才需要。固定液为1%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)，含有1/1000 DEPC。室温固定 10分钟。蒸馏水洗涤3次。
7．预杂交：湿盒的准备——干的杂交盒底部加20%甘油20ml以保持湿度。按每张切片20μι加预杂交液。恒温箱38-42℃2—4小时。吸取多余液体，不洗。
8．杂交——按每张切片20μι杂交液，加在切片上。将原位杂交用盖玻片的保护膜揭开后，盖在切片上。恒温箱38-42℃杂交过夜(根据杂交情况可以调节)。
9．杂交后洗涤：揭掉盖玻片，37℃左右水温的2×SSC洗涤5分钟×2次；37℃0.5×SSC洗涤15分钟×1次; 37℃0.2×SSC洗涤15分钟×1次(如果有非特异性染色，重复0.2×SSC洗涤15分钟×1-2次)。
10.滴加封闭液：37℃30分钟。甩去多余液体，不洗
11.滴加生物素化鼠抗*：37℃ 60分钟或室温120分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×4次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。
12.滴加SABC：37℃20分钟或室温30分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×3次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。
13.滴加生物素化过氧化物酶：37℃20分钟或室温30分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×4次。
14.DAB显色：使用DAB显色试剂盒—1ml蒸馏水加显色剂Ａ，Ｂ，C各一滴，混匀，加至标本上。一般显色20-30分钟。若无背景出现则可继续显色。也可自配DAB显色剂后显色。充分水洗。
15.必要时苏木素复染，充分水洗。
16.酒精脱水，二甲苯透明，封片。
香橙素，香树素 HPLC≥98% 5mg 载玻片细胞APC蛋白表达荧光显微镜检测试剂盒10/20

小构树醇 B HPLC≥98% 5mg MouseHistoneDeacetylase,HDELISAKit小鼠组织蛋白去乙酰化酶(HD)ELISA试剂盒规格：96T/48T

小叶九里香内酯 HPLC≥98% 5mg 小鼠信号素7A(SEMA7A)ELISA试剂盒 ，英文名： SEMA7A ELISA Kit

小芸木香豆精 HPLC≥98% 5mg 兔肾素(Renin)ELISA检测试剂盒RabbieninELISAKit 96T/48T

泻根醇酸 HPLC≥98% 5mg 牛组胺(HIS)试剂盒 Bovine histamine,HIS ELISA kit

辛可宁 HPLC≥98% 5mg 英文名称HumanVIII-AgELISAKit人凝血因子VIII相关抗原(VIII-Ag)规格：96T/48T

辛夷烯酮 HPLC≥98% 5mg 蛋白杂交封闭溶液100毫升

新比克白芷内酯 HPLC≥98% 5mg RatMethylaseELISA试剂盒大鼠甲基化酶(Methylase)ELISA试剂盒规格：96T/48T

新槐胺 HPLC≥98% 5mg 小鼠信号素3E(SEMA3E)ELISA试剂盒 ，英文名： SEMA3E ELISA Kit

星鱼甾醇 HPLC≥98% 5mg 兔子脂联素(ADP)ELISA检测试剂盒rabbitadiponectin,ADPELISAKit 96T/48T
人晶状体蛋白αB(CRYαB)酶联免疫吸附测定试剂盒 别称:CRYAB, CMD1II, CRYA2, CTPP2, HSPB5 Human CRYαB(Crystallin Alpha B) ELISA Kit 用途 该试剂盒用于体外定量检测Human 血清，血浆或其他生物体液中天然及部分重组CRYαB浓度
多片段一步法快速克隆试剂盒人胶质细胞源性连接蛋白(GDN)酶联免疫吸附测定试剂盒 别称:SERPINE2 , GDN, GDNPF, PI-7, PI7, PN-1, PN1, PNI Human GDN(Glia Derived Nexin) ELISA Kit 用途 该试剂盒用于体外定量检测Human 血清，血浆或其他生物体液中天然及部分重组GDN浓度

更新时间：2024/5/7 9:23:47

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