详细内容
本品为溶解于DMSO的淡黄色溶液,浓度为5mM。本品适用于检测细胞内的一氧化氮水平,推荐工作浓度为1-10μM。如果收集细胞后再装载探针,通常至少可以检测100个样品。
产品名称 | 英文名称 | 规格 |
一氧化氮检测探针 | DAF-FM DA Solution (5mM in DMSO) | 100T |
DAF-FM DA即4-Amino-5-Methylamino-2,7-Difluorofluorescein Diacetate,也称DAF-FM Diacetate,是新一代用于一氧化氮(nitric oxide, NO)定量检测的探针,其检测原理为:DAF-FM DA可以穿过活细胞膜(cell-permeable),进入细胞后可以被胞浆内的酯酶催化形成不能穿过细胞膜的DAF-FM。DAF-FM本身仅有很弱的荧光,光量子约0.005,但在与NO反应后生成荧光素-苯骈三氮唑(benzotriazole),发强烈绿色荧光,光量子约0.81。Ex~495nm,Em~515nm。任何可以检测荧光素(fluorescein)的仪器,包括荧光显微镜、激光共聚焦显微镜、流式细胞仪、荧光分光光度计或荧光酶标仪都可以用于该荧光探针的检测。
DAF-FM DA是新一代NO检测探针,与以往成功且应用广泛的一氧化氮荧光检测探针DAF-2 Diacetate相比较,具有多方面的改进:1)DAF-FM DA和NO加合反应形成的荧光产物在pH5.5以上不受pH影响;2)DAF-FM DA和NO加合反应形成的产物荧光更加稳定,不容易淬灭,这样更加便于检测;3)DAF-FM DA对一氧化氮的检测灵敏度更高,其低检测浓度可达到3nM,而DAF-2 Diacetate的低检测浓度约为5nM。
CAS:254109-22-3
分子式:C25H18F2N2O7
分子量:496.42
纯度:>98%
储存条件:-20℃避光,有效期12个月
产品仅用于科研操作程序:
注意:重要的是及时固定,并在固定液中加入0.1%的DEPC处理,以抑制RNA酶对mRNA的分解作用。此外,过度固定对原位杂交有明显的不利影响。
1.玻片的处理:一般采用多聚赖氨酸或APES。切片厚度10-20μm。
2.细胞在多聚赖氨酸处理的盖玻片上进行培养,条件为37℃和5%的CO2,所用培养基为Dulbecco基础培养基。细胞长好后0.1M PBS(PH7.4)洗2分钟×3次。
3.培养细胞和冰冻切片均可用下述方法固定:固定液为4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6),含有1/1000 DEPC。室温固定 20--30分钟。蒸馏水充分洗涤,干燥后-20℃冰冻可保存2周以上。
4.30%H2O2 1份+纯甲醇50份混合,室温处理30分钟。蒸馏水洗涤3次。
5.暴露mRNA核酸片段:切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶(1ml 3% 柠檬酸加2滴浓缩型胃蛋白酶,混匀),37℃或室温消化5—120钟。有时也可以不消化。原位杂交用 PBS洗3次×5分钟。蒸馏水洗1次。
6.后固定:胃蛋白酶消化后才需要。固定液为1%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6),含有1/1000 DEPC。室温固定 10分钟。蒸馏水洗涤3次。
7.预杂交:湿盒的准备——干的杂交盒底部加20%甘油20ml以保持湿度。按每张切片20μι加预杂交液。恒温箱38-42℃2—4小时。吸取多余液体,不洗。
8.杂交——按每张切片20μι杂交液,加在切片上。将原位杂交用盖玻片的保护膜揭开后,盖在切片上。恒温箱38-42℃杂交过夜(根据杂交情况可以调节)。
9.杂交后洗涤:揭掉盖玻片,37℃左右水温的2×SSC洗涤5分钟×2次;37℃0.5×SSC洗涤15分钟×1次; 37℃0.2×SSC洗涤15分钟×1次(如果有非特异性染色,重复0.2×SSC洗涤15分钟×1-2次)。
10.滴加封闭液:37℃30分钟。甩去多余液体,不洗
11.滴加生物素化鼠抗*:37℃ 60分钟或室温120分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×4次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。
12.滴加SABC:37℃20分钟或室温30分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×3次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。
13.滴加生物素化过氧化物酶:37℃20分钟或室温30分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×4次。
14.DAB显色:使用DAB显色试剂盒—1ml蒸馏水加显色剂A,B,C各一滴,混匀,加至标本上。一般显色20-30分钟。若无背景出现则可继续显色。也可自配DAB显色剂后显色。充分水洗。
15.必要时苏木素复染,充分水洗。
16.酒精脱水,二甲苯透明,封片。
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更新时间:2024/3/8 9:32:18
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