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点击次数:1020 发布时间:2022/3/7 10:54:44
本试剂盒适用于人和各种动物体外培养细胞的衰老检测。产品性能稳定,参数经优化,着色敏感。仅对衰老细胞进行染色,不会染色衰老的细胞(presenescent cells)、静止期细胞(quiescent cells)、永生细胞(immortal cells)或肿瘤细胞。
产品名称 | 英文名称 | 规格 |
细胞衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒 | Cell Senescence β-Galactosidase Staining Kit | 100次 |
细胞衰老(Cell senescence)是细胞控制其生长潜能的保障机制,一般含义是复制衰老(Replicative senescence,RS),指正常细胞经过有限次数的分裂后,停止分裂,此时细胞虽然是存活的,但是细胞形态和生理代谢活性发生明显变化的现象。体外衰老细胞研究常用的生物学特征包括:1)不可逆的生长停滞;2)与衰老相关的β-半乳糖苷酶(senescence associated β-galactosidase, SA β-gal)的活化。作为溶酶体内的水解酶,通常在pH 4.0的条件下表现活性。但是衰老细胞内其在pH 6.0的条件下表现活性,且随着传代次数的增加,细胞群体中表现衰老相关的β-半乳糖苷酶的细胞数目逐渐增加。
本试剂盒正是基于SA β-gal活性变化的生物学特征而设计的,门用于对衰老细胞或组织进行染色检测的一种技术。本试剂盒以X-Gal为底物,通过细胞内SA β-gal在酸性条件下稳定表达,催化底物生成深蓝色产物,从而在光学显微镜下观察颜色变化以分析细胞的衰老状况。
产品组份:
清洗液A——————60 ml
固定液B——————60 ml
酸性液C——————120 ml
稀释液D——————38 ml
染色液E——————2 ml
储存条件:-20℃,有效期一年
产品仅用于科研操作程序:
注意:重要的是及时固定,并在固定液中加入0.1%的DEPC处理,以抑制RNA酶对mRNA的分解作用。此外,过度固定对原位杂交有明显的不利影响。
1.玻片的处理:一般采用多聚赖氨酸或APES。切片厚度10-20μm。
2.细胞在多聚赖氨酸处理的盖玻片上进行培养,条件为37℃和5%的CO2,所用培养基为Dulbecco基础培养基。细胞长好后0.1M PBS(PH7.4)洗2分钟×3次。
3.培养细胞和冰冻切片均可用下述方法固定:固定液为4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6),含有1/1000 DEPC。室温固定 20--30分钟。蒸馏水充分洗涤,干燥后-20℃冰冻可保存2周以上。
4.30%H2O2 1份+纯甲醇50份混合,室温处理30分钟。蒸馏水洗涤3次。
5.暴露mRNA核酸片段:切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶(1ml 3% 柠檬酸加2滴浓缩型胃蛋白酶,混匀),37℃或室温消化5—120钟。有时也可以不消化。原位杂交用 PBS洗3次×5分钟。蒸馏水洗1次。
6.后固定:胃蛋白酶消化后才需要。固定液为1%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6),含有1/1000 DEPC。室温固定 10分钟。蒸馏水洗涤3次。
7.预杂交:湿盒的准备——干的杂交盒底部加20%甘油20ml以保持湿度。按每张切片20μι加预杂交液。恒温箱38-42℃2—4小时。吸取多余液体,不洗。
8.杂交——按每张切片20μι杂交液,加在切片上。将原位杂交用盖玻片的保护膜揭开后,盖在切片上。恒温箱38-42℃杂交过夜(根据杂交情况可以调节)。
9.杂交后洗涤:揭掉盖玻片,37℃左右水温的2×SSC洗涤5分钟×2次;37℃0.5×SSC洗涤15分钟×1次; 37℃0.2×SSC洗涤15分钟×1次(如果有非特异性染色,重复0.2×SSC洗涤15分钟×1-2次)。
10.滴加封闭液:37℃30分钟。甩去多余液体,不洗
11.滴加生物素化鼠抗*:37℃ 60分钟或室温120分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×4次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。
12.滴加SABC:37℃20分钟或室温30分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×3次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。
13.滴加生物素化过氧化物酶:37℃20分钟或室温30分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×4次。
14.DAB显色:使用DAB显色试剂盒—1ml蒸馏水加显色剂A,B,C各一滴,混匀,加至标本上。一般显色20-30分钟。若无背景出现则可继续显色。也可自配DAB显色剂后显色。充分水洗。
15.必要时苏木素复染,充分水洗。
16.酒精脱水,二甲苯透明,封片。
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更新时间:2024/5/11 9:49:31
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