碘化丙啶(PI)染液(即用型)

详细内容

本品是无菌的即用型PI染色液（溶于PBS），可进入死细胞内与DNA结合，并被活细胞排斥在外，适合用于流式细胞仪进行细胞活力分析。PI单染用FL2通道检测，若与FITC或PE标记抗体/蛋白联合使用FL3通道检测。

碘化丙啶（Propidium Iodide，PI）是一种常用的细胞核荧光染料，作为一种溴化乙锭（EB）的类似物，能够嵌入碱基对之间实现与双链DNA结合。PI经488 nm荧光激发，产生相对较大的斯托克司频移后，并在617 nm处具有大发射波长。另外，PI不能穿透细胞膜而被排斥在活细胞外，但是可以穿过破损的细胞膜而对核染色。利用以上特性，PI可作为细胞活力分析的荧光探针。不仅可单独使用；也可以同Calcein-AM、Hoechst 33258或 Hoechst 33342等活细胞荧光探针一起使用，同时对活细胞和死细胞染色和鉴定。也能够与488 nm激发的荧光素如FITC和PE等联合使用。

使用方法

1）收集细胞，计数，高以1 x 106 cells/100 μl的量加入FACS分选管；

2）加2ml PBS（或HBSS）清洗细胞，300 x g离心5 min，去上清。重复一次。

注：若需要用抗体标记表面抗原，可在此步之后进行。PI不适合与检测胞内分子的抗体联合使用。

3）细胞清洗后，用100 μl流式细胞染色缓冲液（flow cytometry staining buffer）重悬细胞；加入10 μl PI染色液，轻柔混匀，冰上或者室温避光孵育10-15 min。

4）直接上机进行流式分析。注：PI染色后不可再清洗细胞。PI染色孵育后尽快上机检测。

注意事项

1）碘化丙啶（PI）是已知的诱变剂，操作过程中一定要做好防护工作避免与PI的直接接触。另外PI溶液在丢弃之需要先经过活性炭处理。

2）流式细胞染色缓冲液可配制如下：1×PBS (w/o Ca2+ ａnd Mg2+) + 0.5-1% BSA（或 5% FBS）＋0.1% 叠氮钠。也可根据实验室自身体系调整。

3）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

储存条件：4℃，有效期半年
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产品仅用于科研操作程序：
注意：重要的是及时固定，并在固定液中加入0.1%的DEPC处理，以抑制RNA酶对mRNA的分解作用。此外，过度固定对原位杂交有明显的不利影响。
1．玻片的处理：一般采用多聚赖氨酸或APES。切片厚度10-20μm。
2．细胞在多聚赖氨酸处理的盖玻片上进行培养，条件为37℃和5%的CO2，所用培养基为Dulbecco基础培养基。细胞长好后0.1M PBS(PH7.4)洗2分钟×3次。
3．培养细胞和冰冻切片均可用下述方法固定：固定液为4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)，含有1/1000 DEPC。室温固定 20－－30分钟。蒸馏水充分洗涤，干燥后-20℃冰冻可保存2周以上。
4．30%H2O2 1份+纯甲醇50份混合，室温处理30分钟。蒸馏水洗涤3次。
5．暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶(1ml 3% 柠檬酸加2滴浓缩型胃蛋白酶，混匀)，37℃或室温消化5—120钟。有时也可以不消化。原位杂交用 PBS洗3次×5分钟。蒸馏水洗1次。
6.后固定：胃蛋白酶消化后才需要。固定液为1%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)，含有1/1000 DEPC。室温固定 10分钟。蒸馏水洗涤3次。
7．预杂交：湿盒的准备——干的杂交盒底部加20%甘油20ml以保持湿度。按每张切片20μι加预杂交液。恒温箱38-42℃2—4小时。吸取多余液体，不洗。
8．杂交——按每张切片20μι杂交液，加在切片上。将原位杂交用盖玻片的保护膜揭开后，盖在切片上。恒温箱38-42℃杂交过夜(根据杂交情况可以调节)。
9．杂交后洗涤：揭掉盖玻片，37℃左右水温的2×SSC洗涤5分钟×2次；37℃0.5×SSC洗涤15分钟×1次; 37℃0.2×SSC洗涤15分钟×1次(如果有非特异性染色，重复0.2×SSC洗涤15分钟×1-2次)。
10.滴加封闭液：37℃30分钟。甩去多余液体，不洗
11.滴加生物素化鼠抗*：37℃ 60分钟或室温120分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×4次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。
12.滴加SABC：37℃20分钟或室温30分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×3次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。
13.滴加生物素化过氧化物酶：37℃20分钟或室温30分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×4次。
14.DAB显色：使用DAB显色试剂盒—1ml蒸馏水加显色剂Ａ，Ｂ，C各一滴，混匀，加至标本上。一般显色20-30分钟。若无背景出现则可继续显色。也可自配DAB显色剂后显色。充分水洗。
15.必要时苏木素复染，充分水洗。
16.酒精脱水，二甲苯透明，封片。

更新时间：2024/3/7 10:09:32

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