Ca2+ GPCR分析-钙离子指示探针Fluo-8,AM

详细内容

Fluo-2早是由Roger Tsien博士发明的钙离子指示剂Fluo系列，目，Fluo-3和Fluo-4已成熟商品化。然而，Fluo-2在细胞内比Fluo-4要更明亮，主要可能是由于大部分细胞对Fluo-2的加载能力要高于Fluo-4。

Fluo-3成像涉及到钙离子信号通路的多个方面，Fluo-3经常应用在流式细胞术上，如螯合剂光活化、第二信使、神经递质以及细胞水平的药理筛选。Fluo-3在这些应用里之所以能大量运用主要是由于其几个重要特性：Fluo-3可以被氩离子激光器488nm激发，并在与Ca2+结合后，发射荧光很明亮的荧光信号。Fluo-4是Fluo-3以两个氟原子取代氯原子的类似物，这一微小的结构变化使得Fluo-4探针在488nm激发光下的荧光信号得到增强，信号稳定持续，可以应用于共聚焦显微镜、流式细胞仪、微孔板读数仪。

Fluo-2、Fluo-3和Fluo-4在与Ca2+结合后荧光增强，与紫外激发的探针fura-2和indo-1不同，不会发生光谱漂移。荧光光密度在与Ca2+结合后，增强至少100倍。

加载细胞说明

加载细胞，建议使用膜透性的AM酯类形式的探针，如下操作建议仅供参考。

使用将染料用无水DMSO溶解制成染料的DMSO储液（2～5mM，Fluo-8 MW:1046.93），再用合适培养基稀释一份染料的DMSO储液（2～5mM）到1～10μM的终浓度，加入非离子型去污剂Pluronic F-127可以协助非性的AM酯在水溶液中的扩散。可以简单的通过先等体积混合20%（w/V）的Pluronic与DMSO，确保Pluronic在加载到细胞中的工作浓度是0.02%。

有机阴离子转运抑制剂probenecid（1～2.5mM）或sulfinpyrazone (0.1～0.25mM)可以添加到细胞培养基中，以减少探针在胞脱酯现象。外的Probenecid和sulfinpyrazone储液基本为碱性，因此在添加到培养基中时需要先调整到与所用培养基匹配的pH。

细胞通常可以与AM酯探针在20～37℃条件下孵育20～60分钟，佳的探针加载浓度、时长与温度需要在实验中具体摸索确定。一般来说为了减少可能的毒性超负荷，只要满足足够的荧光检测强度，选择尽可能低的染料浓度。此外，由于亚细胞结构的分区化特点，AM酯加载技术存在固有的标记问题，这可以通过降低孵育温度来解决。

在进行荧光检测之，细胞应用无指示剂的培养基（允许的话，可以添加阴离子转运抑制剂）充分洗涤，以确保洗去细胞表面的非特异性染料吸附，再另外以新鲜培养基孵育30分钟保证胞内酯酶水解充分进行。这里，可能会有少量的指示剂逸出胞外从而产生背景荧光，可以通过临将上机检测之，在外培养基中添加抗荧光素抗体，来降低背景。
大鼠白介素12A(IL12A)elisa检测试剂盒

大鼠白介素11受体α(IL11Rα)elisa检测试剂盒

大鼠白介素11(IL11)elisa检测试剂盒

大鼠白介素10受体β(IL10Rβ)elisa检测试剂盒

大鼠白介素10受体α(IL10Rα)elisa检测试剂盒
大鼠松弛肽/松弛素1(RLN1)elisa检测试剂盒

大鼠松弛肽/松弛素(RLN)elisa检测试剂盒

大鼠丝裂原激活的蛋白激酶1/MAP激酶1(MAPK1)elisa检测试剂盒

大鼠丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶(STK)elisa检测试剂盒

大鼠水闸蛋白1(Cldn1)elisa检测试剂盒
Ca2+ GPCR分析-钙离子指示探针Fluo-8,AM人白蛋白（ALB）elisa检测试剂盒

人白喉抗体(Diphtheria Ab)elisa分析检测试剂盒

人白喉抗体(Diphtheria Ab)elisa检测试剂盒

人白介素-1（IL-1）elisa检测试剂盒

人白介素10(IL-10)elisa分析检测试剂盒
产品仅用于科研操作程序：
注意：重要的是及时固定，并在固定液中加入0.1%的DEPC处理，以抑制RNA酶对mRNA的分解作用。此外，过度固定对原位杂交有明显的不利影响。
1．玻片的处理：一般采用多聚赖氨酸或APES。切片厚度10-20μm。
2．细胞在多聚赖氨酸处理的盖玻片上进行培养，条件为37℃和5%的CO2，所用培养基为Dulbecco基础培养基。细胞长好后0.1M PBS(PH7.4)洗2分钟×3次。
3．培养细胞和冰冻切片均可用下述方法固定：固定液为4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)，含有1/1000 DEPC。室温固定 20－－30分钟。蒸馏水充分洗涤，干燥后-20℃冰冻可保存2周以上。
4．30%H2O2 1份+纯甲醇50份混合，室温处理30分钟。蒸馏水洗涤3次。
5．暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶(1ml 3% 柠檬酸加2滴浓缩型胃蛋白酶，混匀)，37℃或室温消化5—120钟。有时也可以不消化。原位杂交用 PBS洗3次×5分钟。蒸馏水洗1次。
6.后固定：胃蛋白酶消化后才需要。固定液为1%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)，含有1/1000 DEPC。室温固定 10分钟。蒸馏水洗涤3次。
7．预杂交：湿盒的准备——干的杂交盒底部加20%甘油20ml以保持湿度。按每张切片20μι加预杂交液。恒温箱38-42℃2—4小时。吸取多余液体，不洗。
8．杂交——按每张切片20μι杂交液，加在切片上。将原位杂交用盖玻片的保护膜揭开后，盖在切片上。恒温箱38-42℃杂交过夜(根据杂交情况可以调节)。
9．杂交后洗涤：揭掉盖玻片，37℃左右水温的2×SSC洗涤5分钟×2次；37℃0.5×SSC洗涤15分钟×1次; 37℃0.2×SSC洗涤15分钟×1次(如果有非特异性染色，重复0.2×SSC洗涤15分钟×1-2次)。
10.滴加封闭液：37℃30分钟。甩去多余液体，不洗
11.滴加生物素化鼠抗*：37℃ 60分钟或室温120分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×4次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。
12.滴加SABC：37℃20分钟或室温30分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×3次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。
13.滴加生物素化过氧化物酶：37℃20分钟或室温30分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×4次。
14.DAB显色：使用DAB显色试剂盒—1ml蒸馏水加显色剂Ａ，Ｂ，C各一滴，混匀，加至标本上。一般显色20-30分钟。若无背景出现则可继续显色。也可自配DAB显色剂后显色。充分水洗。
15.必要时苏木素复染，充分水洗。
16.酒精脱水，二甲苯透明，封片。

更新时间：2023/11/6 14:17:54

快速询价

留言框
感兴趣的产品：	*
您的单位：	*
您的姓名：	*
联系电话：	*
详细地址：
常用邮箱：
您的任何要求、意见或建议： *
验证码：	*