氯离子荧光探针 MEQ (6-甲氧-N-乙基喹啉碘)(CoFM FACS)

详细内容

MEQ（MQAE）是一个6-甲氧基花青苷衍生物，是细胞内的Cl-荧光指示剂，该染料可以通过受被动扩散所控制的碰撞淬灭来检测离子浓度。目，检测Cl-所用荧光染料主要是MQAE 和SPQ，MQAE 相比SPQ 来说对于Cl-的浓度有更高的灵敏度和更高的荧光量子比率。

MQAE 的工作液可以配制于Krebs-HEPES 缓冲液中。Krebs-HEPES 缓冲液即为20mM HEPES，128mM NaCl，2.5mM KCl，2.7mMCaCl2，1mM MgCl2，16mM glucose，pH7.4。MQAE 标记细胞时的浓度通常为5-10mM。以约800-1000 万细胞每毫升的细胞密度，在含有5-10mM MQAE 的Krebs-HEPES 缓冲液中孵育30-60 分钟。通常一个探针的装载体系为100 微升即可。随后用Krebs-HEPES缓冲液或其它适当溶液洗涤5 次左右，即可进行相应荧光测定。详细的使用方法请参考相关文献。以下对胞内氯离子的荧光测量[Cl-]做简要说明计算。Stem-Volmer 方程可以给出氯离子探针的荧光强度与氯离子浓度的关系：

(FO/F) – 1 = KSV[Q]

FO 是没有卤化物或其他淬灭离子时的荧光强度，F 是有淬灭剂时的荧光强度，[Q]是淬灭剂浓度，而KSV 是Stem-Volmer 方程常数。建议对实验体系进行校准，以得到研究用细胞类型的指示剂探针的Ksv，利用线性回归模型分析Stem-Volmer 方程。Stem-Volmer 方程中的氯离子Ksv 常数可以随着碰撞淬灭的阴离子物质的增多而明显降低，如多肽。便于校准，可以固定胞内氯离子的浓度，通过使用双三丁基氧化锡和尼日利亚菌素10~30μM。为了保证渗透压好使用阴离子不淬灭染料，取代氯离子，如葡萄糖酸。

储存：-20℃，避光，有效期6个月。
产品仅用于科研操作程序：
注意：重要的是及时固定，并在固定液中加入0.1%的DEPC处理，以抑制RNA酶对mRNA的分解作用。此外，过度固定对原位杂交有明显的不利影响。
1．玻片的处理：一般采用多聚赖氨酸或APES。切片厚度10-20μm。
2．细胞在多聚赖氨酸处理的盖玻片上进行培养，条件为37℃和5%的CO2，所用培养基为Dulbecco基础培养基。细胞长好后0.1M PBS(PH7.4)洗2分钟×3次。
3．培养细胞和冰冻切片均可用下述方法固定：固定液为4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)，含有1/1000 DEPC。室温固定 20－－30分钟。蒸馏水充分洗涤，干燥后-20℃冰冻可保存2周以上。
4．30%H2O2 1份+纯甲醇50份混合，室温处理30分钟。蒸馏水洗涤3次。
5．暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶(1ml 3% 柠檬酸加2滴浓缩型胃蛋白酶，混匀)，37℃或室温消化5—120钟。有时也可以不消化。原位杂交用 PBS洗3次×5分钟。蒸馏水洗1次。
6.后固定：胃蛋白酶消化后才需要。固定液为1%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)，含有1/1000 DEPC。室温固定 10分钟。蒸馏水洗涤3次。
7．预杂交：湿盒的准备——干的杂交盒底部加20%甘油20ml以保持湿度。按每张切片20μι加预杂交液。恒温箱38-42℃2—4小时。吸取多余液体，不洗。
8．杂交——按每张切片20μι杂交液，加在切片上。将原位杂交用盖玻片的保护膜揭开后，盖在切片上。恒温箱38-42℃杂交过夜(根据杂交情况可以调节)。
9．杂交后洗涤：揭掉盖玻片，37℃左右水温的2×SSC洗涤5分钟×2次；37℃0.5×SSC洗涤15分钟×1次; 37℃0.2×SSC洗涤15分钟×1次(如果有非特异性染色，重复0.2×SSC洗涤15分钟×1-2次)。
10.滴加封闭液：37℃30分钟。甩去多余液体，不洗
11.滴加生物素化鼠抗*：37℃ 60分钟或室温120分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×4次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。
12.滴加SABC：37℃20分钟或室温30分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×3次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。
13.滴加生物素化过氧化物酶：37℃20分钟或室温30分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×4次。
14.DAB显色：使用DAB显色试剂盒—1ml蒸馏水加显色剂Ａ，Ｂ，C各一滴，混匀，加至标本上。一般显色20-30分钟。若无背景出现则可继续显色。也可自配DAB显色剂后显色。充分水洗。
15.必要时苏木素复染，充分水洗。
16.酒精脱水，二甲苯透明，封片。
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更新时间：2024/4/19 9:58:10

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