钾离子荧光探针

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Na+敏感型染料,SBFI 和K+敏感型染料,PBFI，是钠钾离子浓度测定时所用到的选择性荧光指示剂。这类苯并呋喃间苯二甲酸酯的衍生物以及其具有膜透性的乙酰氧基甲基酯形式（AM 酯）可以在生理条件（含多种其他一价阳离子）下，给予钠钾离子浓度以上时间及空间上准确的变化测量精度。

此外，这类染料的激光光谱可以选择用与Fura-2 类似的滤光器与检测仪。.这些钠钾探针指示剂由荧光团与氮冠醚成环状连接，赋予各自的配位体选择性。在pH7，且Na 或K 离子缺失的情况下，SBFI 和PBFI 的消光系数大约在42,000 cm-1M-1（346 nm）。一旦与离子结合，其激发峰显著收窄，大激发峰向短波段偏移，光能量吸收比值变为340nm/380nm。SBFI 结合Na离子之后荧光强度约增强2.5 倍，但发射光谱大值基本不变。pH6.5～7.5，这类荧光素的光谱特性基本维持不变，相比较而言，离子浓度和粘度对其影响更大。

虽然这类离子指示剂有相当的选择性，但对于Na 离子亲和的SBFI 来说K 离子同样有一定的影响，PBFI 也是如此。在K 离子生理浓度下，SBFI 对于Na 的Kd 值为11.3mM，而没有K 离子存在时，则为3.8mM。SBFI 对Na 的选择性比K 要高出18 倍。

同样地，PBFI 对K 离子的解离常数也强烈地依赖于Na 的存在。Na 的是否存在，使得PBFI 对于K 离子的Kd 从100mM 到10mM不等。虽然PBFI 对于K 离子的选择性仅仅高出Na 的1.5 倍，但在细胞的生理条件下，通常K 离子的浓度要高于Na 的10 倍以上。所以，在胞内加载探针时，这些探针的Kd 值应与适当的载体做校准。

用无水DMSO 制备PBFI AM 酯类的储液，浓度为10mM。PBFI AM 的相对分子量为1171.由于这类AM 酯形式的探针水溶性比较差，建议溶解时，使用必要的Pluronic F-127.通常可以在进行加载探针到细胞之，将探针的DMSO 溶液与等体积25%（w/V）的PluronicF-127 混合。探针加载浓度范围：5μM～10μM，孵育时间40 分钟~4 小时。具体的加载条件好能参考相关文献或者实验摸索，因为该探针在不同的细胞内的Kd 值不同。校准细胞内PBFI 使用K+离子载体缬氨酶素。

一般来说，这些指示探针可以用340nm 激发光激发，但在380nm 荧光对于目的离子的浓度尤其敏感。发射峰的检测可以设置在500nm，计算Na+ K+的浓度。
产品仅用于科研操作程序：
注意：重要的是及时固定，并在固定液中加入0.1%的DEPC处理，以抑制RNA酶对mRNA的分解作用。此外，过度固定对原位杂交有明显的不利影响。
1．玻片的处理：一般采用多聚赖氨酸或APES。切片厚度10-20μm。
2．细胞在多聚赖氨酸处理的盖玻片上进行培养，条件为37℃和5%的CO2，所用培养基为Dulbecco基础培养基。细胞长好后0.1M PBS(PH7.4)洗2分钟×3次。
3．培养细胞和冰冻切片均可用下述方法固定：固定液为4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)，含有1/1000 DEPC。室温固定 20－－30分钟。蒸馏水充分洗涤，干燥后-20℃冰冻可保存2周以上。
4．30%H2O2 1份+纯甲醇50份混合，室温处理30分钟。蒸馏水洗涤3次。
5．暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶(1ml 3% 柠檬酸加2滴浓缩型胃蛋白酶，混匀)，37℃或室温消化5—120钟。有时也可以不消化。原位杂交用 PBS洗3次×5分钟。蒸馏水洗1次。
6.后固定：胃蛋白酶消化后才需要。固定液为1%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)，含有1/1000 DEPC。室温固定 10分钟。蒸馏水洗涤3次。
7．预杂交：湿盒的准备——干的杂交盒底部加20%甘油20ml以保持湿度。按每张切片20μι加预杂交液。恒温箱38-42℃2—4小时。吸取多余液体，不洗。
8．杂交——按每张切片20μι杂交液，加在切片上。将原位杂交用盖玻片的保护膜揭开后，盖在切片上。恒温箱38-42℃杂交过夜(根据杂交情况可以调节)。
9．杂交后洗涤：揭掉盖玻片，37℃左右水温的2×SSC洗涤5分钟×2次；37℃0.5×SSC洗涤15分钟×1次; 37℃0.2×SSC洗涤15分钟×1次(如果有非特异性染色，重复0.2×SSC洗涤15分钟×1-2次)。
10.滴加封闭液：37℃30分钟。甩去多余液体，不洗
11.滴加生物素化鼠抗*：37℃ 60分钟或室温120分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×4次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。
12.滴加SABC：37℃20分钟或室温30分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×3次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。
13.滴加生物素化过氧化物酶：37℃20分钟或室温30分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×4次。
14.DAB显色：使用DAB显色试剂盒—1ml蒸馏水加显色剂Ａ，Ｂ，C各一滴，混匀，加至标本上。一般显色20-30分钟。若无背景出现则可继续显色。也可自配DAB显色剂后显色。充分水洗。
15.必要时苏木素复染，充分水洗。
16.酒精脱水，二甲苯透明，封片。
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更新时间：2024/5/17 16:19:06

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