生物素标记DNA探针制备试剂盒(随机引物法)

详细内容

本试剂盒是一种通过随机引物标记反应产生生物素标记DNA探针的试剂盒。本试剂盒标记的生物素DNA探针可以用于常规的Northern、Southern、colony或plaque hybridization、dot或slot blot、原位杂交等。

在Klenow酶(3＇-5＇exo-)催化下，通过随机引物标记反应可以把生物素标记的Biotin-11-dUTP掺入到新合成的DNA探针中，这样就可以产生生物素标记的DNA探针。在随机引物标记反应过程中，一些标记好的DNA探针可以被Klenow酶从模板DNA链上驱赶下来。这样在模板量较少的情况下，通过随机引物标记反应，后可以产生比模板DNA量更多的生物素标记DNA探针，可多达1～15倍左右。

本试剂盒可以用于多种DNA模板的标记，包括DNA片段、线性化的质粒或cosmid、超螺旋DNA等。用于本试剂盒的模板DNA片段应不小于100bp，小于100bp的DNA模板可以使用生产的生物素3＇末端DNA标记试剂盒(YT030)进行DNA探针标记。

用于本试剂盒的模板DNA的量应不少于10ng，推荐的模板用量为100ng～1μg。

本试剂盒中提供了已经用生物素标记好的Biotin-Control DNA，可以用作检测生物素DNA探针标记效率的对照。生物素标记DNA可以使用生产的化学发光法生物素标记核酸检测试剂盒(YT032)或其它适当试剂盒进行检测。

储存条件：-20℃。

大鼠α2巨球蛋白(α2-MG)elisa检测试剂盒

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大鼠色氨酸羟化酶(TPH)elisa检测试剂盒免费代测

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人α2巨球蛋白(α2-MG)elisa分析检测试剂盒

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人α2抗纤溶酶(α2-AP)elisa分析检测试剂盒

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产品仅用于科研操作程序：
注意：重要的是及时固定，并在固定液中加入0.1%的DEPC处理，以抑制RNA酶对mRNA的分解作用。此外，过度固定对原位杂交有明显的不利影响。
1．玻片的处理：一般采用多聚赖氨酸或APES。切片厚度10-20μm。
2．细胞在多聚赖氨酸处理的盖玻片上进行培养，条件为37℃和5%的CO2，所用培养基为Dulbecco基础培养基。细胞长好后0.1M PBS(PH7.4)洗2分钟×3次。
3．培养细胞和冰冻切片均可用下述方法固定：固定液为4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)，含有1/1000 DEPC。室温固定 20－－30分钟。蒸馏水充分洗涤，干燥后-20℃冰冻可保存2周以上。
4．30%H2O2 1份+纯甲醇50份混合，室温处理30分钟。蒸馏水洗涤3次。
5．暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶(1ml 3% 柠檬酸加2滴浓缩型胃蛋白酶，混匀)，37℃或室温消化5—120钟。有时也可以不消化。原位杂交用 PBS洗3次×5分钟。蒸馏水洗1次。
6.后固定：胃蛋白酶消化后才需要。固定液为1%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)，含有1/1000 DEPC。室温固定 10分钟。蒸馏水洗涤3次。
7．预杂交：湿盒的准备——干的杂交盒底部加20%甘油20ml以保持湿度。按每张切片20μι加预杂交液。恒温箱38-42℃2—4小时。吸取多余液体，不洗。
8．杂交——按每张切片20μι杂交液，加在切片上。将原位杂交用盖玻片的保护膜揭开后，盖在切片上。恒温箱38-42℃杂交过夜(根据杂交情况可以调节)。
9．杂交后洗涤：揭掉盖玻片，37℃左右水温的2×SSC洗涤5分钟×2次；37℃0.5×SSC洗涤15分钟×1次; 37℃0.2×SSC洗涤15分钟×1次(如果有非特异性染色，重复0.2×SSC洗涤15分钟×1-2次)。
10.滴加封闭液：37℃30分钟。甩去多余液体，不洗
11.滴加生物素化鼠抗*：37℃ 60分钟或室温120分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×4次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。
12.滴加SABC：37℃20分钟或室温30分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×3次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。
13.滴加生物素化过氧化物酶：37℃20分钟或室温30分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×4次。
14.DAB显色：使用DAB显色试剂盒—1ml蒸馏水加显色剂Ａ，Ｂ，C各一滴，混匀，加至标本上。一般显色20-30分钟。若无背景出现则可继续显色。也可自配DAB显色剂后显色。充分水洗。
15.必要时苏木素复染，充分水洗。
16.酒精脱水，二甲苯透明，封片。

更新时间：2024/2/4 9:39:33

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