特征特性 该细胞是采用慢病毒感染的方式使Caki-1细胞稳定表达Cas9-Flag-Neo,经400ug/mlG418筛选得到的单克隆,经Western Blotting验证该克隆可以表达Cas9蛋白,可直接用Crispr技术编辑基因组DNA。
Cas9稳定表达的人肾透明细胞癌;Caki-1-Cas9-593品牌对于贴壁细胞,传代可参考以下方法:
1. 弃去培养上清,用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
2. 加2ml消化液(0.25%Trypsin-0.53mM EDTA)于培养瓶中,置于37℃培养箱中消化1-2分钟,然后在显微镜下观察Ⅱ型肺泡上皮细胞|细胞消化情况,若细胞大部分变圆并脱落,迅速拿回操作台,轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。
3. 按6-8ml/瓶补加培养基,轻轻打匀后吸出,在1000RPM条件下离心4分钟,弃去上清液,补加1-2mL培养液后吹匀。
4. 将细胞悬液按1:2到1:5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。
【细胞冻存】
Cas9稳定表达的人肾透明细胞癌;Caki-1-Cas9-593品牌待细胞生长状态良好时,可进行293/HEK-293细胞|细胞冻存。贴壁细胞冻存时,弃去培养基后加入少量胰酶,细胞变圆脱落后,加入约1ml含血清的培养基后加入冻存管中,再添加10%DMSO后进行冻存。悬浮细胞冻存时,应将细胞收集,1000RPM条件下离心4分钟,少量保存上清液(防止细胞吸走),加入部分新鲜培养基,加入到冻存管中,在冻存管中加入10%DMSO后进行冻存。
【复苏的原则】
快速融化:必须将冻存在-196℃液氮中的细胞快速融化至37℃,使细胞外冻存时的冰晶迅速融化,避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶,对细胞造成损害。复旦细胞库全国各地均可发货,全国统一价格,本公司出售的所有细胞仅供科研使用。
细胞培养的优点:pH、温度、氧气、二氧化碳、张力等物理化学的条件,可以根据实际需要进行人为的控制,同时,可以施加化学、物理、生物等因素作为条件而进行实验观察,这些因素同样可以处于严格控制之下。
采用各种研究技术:如倒置生物显微镜、荧光显微镜、电子显微镜、流式细胞术、激光共焦显微镜、免疫组织化学、原位杂交、同位素标记等各种
仪器设备。
实验报告:
一、Cas9稳定表达的人肾透明细胞癌;Caki-1-Cas9-593品牌分离与培养:
1、无菌条件下,取出1-3d 龄SD大鼠心房组织,然后用PBS将此组织块清洗2次,*后将组织剪成1mm3左右大小;
2、往组织块中加入4 mL酶消化液(0.1% 胰酶和0.1% I型胶原酶),混悬10s,置37℃条件下消化10min,之后用滴管吹打制成单细胞悬液,自然沉淀并收集上清,用含10% FBS培养基终止消化后4℃放置;
3、剩下的组织再加入3~4mL酶消化液,混悬10s,置37℃消化10 min后,按上述方法收集上清并终止消化后4℃放置,重复此步骤2-3次,直至组织完全被消化;
4、用200目不锈钢筛网过滤细胞消化液,1200r/min 离心10min,弃去上清,沉淀细胞用含有10% FBS DMEM/F12培养基混悬,接种于25cm2培养瓶,放置于37℃ ,5%CO2 培养箱中培养;
5、差速贴壁1h后,吸出培养基,按实验需要接种于6孔板中继续培养;
二、免疫荧光鉴定:
1、待心房肌细胞生长至80%融合时,弃去培养基,用温育的PBS冲洗细胞2次,每次10min,然后用4%多聚甲醛在室温条件下固定细胞15min;
2、PBS冲洗细胞2次,每次10min,然后在4℃条件下,用0.1%Triton X-100透膜15min;
3、PBS冲洗细胞2次,每次10min,然后在室温条件下,用4% BSA封闭细胞30min;
4、按1: 100的比例稀释α-actin一抗(Abbioscience公司),然后将其放在4℃冰箱中孵育细胞过夜;
5、PBS冲洗细胞3次,每次10min,按1:150的比例稀释抗α-actin的二抗(嘉美生物公司), 37℃条件下放置1h;
6、用PBS冲洗3次,每次10min,*后在倒置荧光显微镜(Leica公司)下观察图像并拍照。
5-胞苷三嶙酸四钠盐溶液shēng huà shì jì容量:25克
1186-52-3氘代乙酸-D4ACETIC-D3 ACID-D
煌绿黄胺嘧啶琼脂500克
α-甲基-D-甘露糖苷 Methyl α-D-mannopyranoside,≥99% 617-04-9 5G 通用试剂
欧前胡速 Impqrctorin 48-44-0
精胺shēng huà shì jì容量:保存:-20℃1毫克
9005-80-5菊糖;菊淀粉;旋复;土木香粉Inulin;Alant starch;Dahlin;Menyanthin
普通肉汤琼脂培养基shēng huà shì jì容量:2~8℃,避光25克
2- 2-Pyridinemethanol,98% 586-98-1 25G 通用试剂
铬酸铅/铬黄/Lead chromate AR,98%, 500克 国产
兰,英文名或英文缩写:Toluidine bule,级别:BR,98%,规格:100毫克
(8-氮鸟嘌呤)
花宝5号,英文名或英文缩写:N-P-K,级别:生物技术级,98%,规格:5毫克
铯标准溶液 Cqsium 7440-46-
SSCBUFFER,20XLIQUIDCONCENTRATESSC缓冲液,20X 浓缩液超纯级透明无色液体RTsigma
葡萄球菌选择性琼脂250g用于凝固酶阳性葡萄球菌的选择性分离培养
KAgar
胰酪胨大豆多粘菌素肉汤基础 Trypticase-Soy-Polymyxin Broth Base 250 用于蜡样芽孢杆菌的MPN值测定 (SN标准)
2220酶Ⅰ(NAD)溶液25mg×盒incubationmedia2220酶Ⅰ(NAD)溶液25mg×盒
碱性蛋白胨水 225ml/袋*10 用于菌选择性增菌培养(SN标准)
改良HC琼脂添加剂每支添加于HB8597中
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T1N3肉汤 T1N3 Broth 250克 菌的生长试验
改良BPLS琼脂250用于各种标本中沙门氏菌选择性分离培养(ISO标准)incubationmedia改良BPLS琼脂250用于各种标本中沙门氏菌选择性分离培养(ISO标准)
BrilliantGreenAgarw/Sulfadiazine
注意事项: