人端粒酶活性荧光实时定量PCR法检测试剂盒

详细内容

端粒是真核生物染色体末端特殊的DNA-蛋白结构，含多个重复序列（5＇-TTAGGG-3＇），端粒结构的形成和功能的维持需要端粒结合蛋白的直接或间接参与。端粒酶是细胞体内一种核糖核蛋白复合体，是由RNA和蛋白质亚基组成的一种特殊的逆转录酶，其可以利用自身的RNA模板合成末端DNA，并添加到染色体末端以克服末端序列的丢失，从而使细胞获得增殖能力。

端粒酶蛋白催化亚基（TERT或TRT）具有反转录酶的主要特征，其表达在正常细胞中受到抑制，研究表明，TERT或TRT的表达与端粒酶活性的表达一致，与端粒酶的活化程度密切相关。Wisman等在人卵巢癌中利用逆转录PCR检测hTERT的mRNA的表达，并采用TRAP法检测端粒酶活性，结果证实二者均存在于恶性肿瘤中并且表达模式相同。基于上述原理，实时荧光定量PCR端粒酶检测试剂盒通过检测TERT的mRNA表达水平来间接反应端粒酶的活性。

实时荧光定量PCR（SYBR Green Real-time PCR）方法以其卓越的快速性及定量性被广泛应用于科研域，使用本试剂盒可以准确简便地进行mRNA的表达分析。试剂盒采用SYBR Green qPCR Master Mix为荧光实时定量PCR和Two-Step荧光实时定量PCR设计的优反应体系，并结合特异性的细胞端粒酶催化亚基基因TERT引物，简化实验步骤和提高实验效率。Master Mix含有Maxima Hot Start Taq DNA聚合酶、dNTPS、进行优化处理的PCR反应缓冲液以及SYBR Green染料。使用Hot Start Taq DNA聚合酶，为PCR反应提供了更高的产量和灵敏度、特异性，能够检测低至10个拷贝的目的基因。

本试剂盒适应于大多数的Real-time PCR扩增仪，包括Applied Biosystems，Eppendorf，Corbett，Bio-Rad，Roche，杭州博日（Line-GeneBioer）等品牌的PCR扩增仪。

备注：

建议采用25μL的实验体系，如果改变请参照其余说明进行调整。

主反应混合液Master mix含有除模板、引物外的全部组分，避免其反复冻融和污染是进行一个成功实时定量PCR反应的重要步骤。

PCR扩增仪设定时需要建立起始10分钟、95℃的变性程序以激活Maxima Hot Start DNA聚合酶。

一般实时定量实验中采用适宜体系确保Maxima qPCR Master Mix的小化，避免产生大量的荧光强度。

针对不同实验条件和仪器型号重新调整荧光阈值。

当使用Bio-Rad的iCycler iQ或MyiQ system时请按照仪器生产商的说明进行实验。
2-Cyclopropyl-4-(4-fluorophenyl)-quinolyl-3-methanol  121660-11-5  中文名： 分子式：C19H16FNO    humanai-neuophilcylasmicaibody,cANCAELISAKit 人抗中性粒细胞胞浆抗体(cANCA)ELISA试剂盒 96T/48T 进口分装

3-(Bromomethyl)-2-cyclopropyl-4-(4＇-fluorophenyl)quinoline  154057-56-4  中文名： 分子式：C19H15BrFN    HumanCytochromeP450c21/21-hydroxylase,CYP21BELISA试剂盒人细胞色素P450c21B/21-羟化酶(CYP21B)ELISA试剂盒规格：96T/48T

3-[2-Cyclopropyl-4-(4-fluorophenyl)-3-quinolinyl-2-propenal  148901-68-2  中文名： 分子式：C21H16FNO    组织HHV6-B(HUMANHERPESVIRUS6-B)病毒定量PCR扩增检测试剂盒20次

Pitavastatin ethyl ester  167073-19-0  中文名： 分子式：C27H28FNO4    Humanplatelet-derivedgrowthfactor，PDGFELISAKit人血小板衍生生长因子(PDGF)ELISA试剂盒规格：96T/48T

2-Cyclopropyl-3-[(diphenylphosphinyl)methyl]-4-(4-fluorophenyl)quinoline  146578-99-6  中文名： 分子式：C31H25FNOP    兔子组胺(HIS)ELISA 试剂盒 96T/48T 试剂盒 组装/原装
氨基三乙酸（标准品）  Nitrilotriacetic acid  质量规格：供HPLC法杂质检查用 ELISAKitCyclin-D3人细胞周期素D3规格：48T/96T

1，3-（标准品）  1,3- Propylene Glycol  质量规格：供检查用 小鼠甘酸脱氢酶(GLDC)ELISA试剂盒 ，英文名： GLDC ELISA Kit

二甘醇（标准品）  Diethylene Glycol  质量规格：供检查用 人碱性胎儿蛋白(BFP)ELISA检测试剂盒Humanbasicferotein,BFPELISAKit 96T/48T

氯噻嗪（标准品）  Chlorothiazide  质量规格：供HPLC法系统适用性试验用 大鼠三甲状腺原氨酸(T3)试剂盒 Rat i-iodothyronine,T3 ELISA Kit

盐酸阿米洛利杂质（4-氨基-6-氯-1，3-苯基二硫酰胺）（标准品）  4-amino-6-chloro-1,3-benzenedisulfonamide  质量规格：供检查用 英文名称RatthrombieceptorELISAKit大鼠凝血酶受体()规格：96T/48T

盐酸地芬尼多杂质（烯化合物)（标准品）  Alkene  质量规格：供检查用 活体组织线粒体内膜功能/膜电位测定试剂盒10

N-甲基帕罗西汀（标准品）  N-Methylparoxetine  质量规格：供检查用 ELISAKitMEPE人细胞外基质0酸糖蛋白规格：48T/96T

七氟烷（标准品）  Sevoflurane  质量规格：供GC法检查用 小鼠甘露糖受体C2(MRC2)ELISA试剂盒 ，英文名： MRC2 ELISA Kit

二甲氧苄啶（标准品）  Diaveridine  质量规格：检查 人副甲状旁腺激素相关肽(PTHrp)ELISA检测试剂盒Humanparathyroidhormonerelatedpeptide,PTHrpELISAKit 96T/48T

美雄诺龙（标准品）  Mestanolone  质量规格：供HPLC法系统适用性试验用 大鼠山梨醇脱氢酶(SDH)试剂盒 Rat sorbitol dehydrogenase,SDH ELISA Kit
人端粒酶活性荧光实时定量PCR法检测试剂盒N-十八烷酰二氢-D-赤-鞘氨醇  N-Stearoyldihydro-D-erythro-Sphingosine  质量规格：美国进口 载玻片细胞P38蛋白表达NBT显色光学显微镜检测试剂盒10/20

Fmoc-3-苯甲酰-赤-鞘氨醇  Fmoc-3-benzoyl-erythro-sphingosine  质量规格：美国进口 载玻片细胞PAR-1蛋白表达NBT显色光学显微镜检测试剂盒10/20

D-赤-鞘氨醇(硫酸)  D-erythro-Sphingosine (sulfate)  质量规格：美国进口 载玻片细胞PAR-1蛋白表达荧光显微镜检测试剂盒10/20

D-赤-鞘氨醇-1-盐  D-erythro-Sphingosine-1-phosphate  质量规格：美国进口 载玻片细胞PAR-2蛋白表达NBT显色光学显微镜检测试剂盒10/20

N-十八烷酰-D-鞘氨醇  N-Stearoyl-D-Sphingosine  质量规格：美国进口 载玻片细胞PAR-3蛋白表达NBT显色光学显微镜检测试剂盒10/20

二氢-D-赤-鞘氨醇  Dihydro-D-erythro-Sphingosine  质量规格：美国进口 载玻片细胞PAR-3蛋白表达荧光显微镜检测试剂盒10/20

N-油酰-D-赤-鞘氨醇  D-erythro-Sphingosine, N-Oleoyl-  质量规格：美国进口 载玻片细胞PARP蛋白表达NBT显色光学显微镜检测试剂盒10/20

D-赤-鞘氨醇C-20  D-erythro-Sphingosine C-20  质量规格：美国进口 载玻片细胞PDGF-A蛋白表达NBT显色光学显微镜检测试剂盒10/20

L-苏型-鞘氨醇C-18  L-threo-Sphingosine C-18  质量规格：美国进口 载玻片细胞PDGF-A蛋白表达荧光显微镜检测试剂盒10/20

C16 神经酰胺(N-十六烷酰鞘氨醇,D-赤)  C16 Ceramide (N-Palmitoylsphingosine, D-erythro)  质量规格：美国进口 载玻片细胞PDGF-B蛋白表达NBT显色光学显微镜检测试剂盒10/20
产品仅用于科研操作程序：
注意：重要的是及时固定，并在固定液中加入0.1%的DEPC处理，以抑制RNA酶对mRNA的分解作用。此外，过度固定对原位杂交有明显的不利影响。
1．玻片的处理：一般采用多聚赖氨酸或APES。切片厚度10-20μm。
2．细胞在多聚赖氨酸处理的盖玻片上进行培养，条件为37℃和5%的CO2，所用培养基为Dulbecco基础培养基。细胞长好后0.1M PBS(PH7.4)洗2分钟×3次。
3．培养细胞和冰冻切片均可用下述方法固定：固定液为4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)，含有1/1000 DEPC。室温固定 20－－30分钟。蒸馏水充分洗涤，干燥后-20℃冰冻可保存2周以上。
4．30%H2O2 1份+纯甲醇50份混合，室温处理30分钟。蒸馏水洗涤3次。
5．暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶(1ml 3% 柠檬酸加2滴浓缩型胃蛋白酶，混匀)，37℃或室温消化5—120钟。有时也可以不消化。原位杂交用 PBS洗3次×5分钟。蒸馏水洗1次。
6.后固定：胃蛋白酶消化后才需要。固定液为1%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)，含有1/1000 DEPC。室温固定 10分钟。蒸馏水洗涤3次。
7．预杂交：湿盒的准备——干的杂交盒底部加20%甘油20ml以保持湿度。按每张切片20μι加预杂交液。恒温箱38-42℃2—4小时。吸取多余液体，不洗。
8．杂交——按每张切片20μι杂交液，加在切片上。将原位杂交用盖玻片的保护膜揭开后，盖在切片上。恒温箱38-42℃杂交过夜(根据杂交情况可以调节)。
9．杂交后洗涤：揭掉盖玻片，37℃左右水温的2×SSC洗涤5分钟×2次；37℃0.5×SSC洗涤15分钟×1次; 37℃0.2×SSC洗涤15分钟×1次(如果有非特异性染色，重复0.2×SSC洗涤15分钟×1-2次)。
10.滴加封闭液：37℃30分钟。甩去多余液体，不洗
11.滴加生物素化鼠抗*：37℃ 60分钟或室温120分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×4次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。
12.滴加SABC：37℃20分钟或室温30分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×3次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。
13.滴加生物素化过氧化物酶：37℃20分钟或室温30分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×4次。
14.DAB显色：使用DAB显色试剂盒—1ml蒸馏水加显色剂Ａ，Ｂ，C各一滴，混匀，加至标本上。一般显色20-30分钟。若无背景出现则可继续显色。也可自配DAB显色剂后显色。充分水洗。
15.必要时苏木素复染，充分水洗。
16.酒精脱水，二甲苯透明，封片。

更新时间：2024/5/6 9:36:24

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